L’ossigeno-ozono terapia nel 2005
Tratto da Medicina Naturale n° 4 - Luglio 2005

di Velio Bocci, MD, Università di Siena

L’utilizzo ottimale dell’ozono

L’ozono è costituito da una molecola con tre atomi di ossigeno in una struttura ciclica e instabile tanto da avere una breve emivita (40 min a +20 °C) per cui deve essere preparato e usato estemporaneamente utilizzando ossigeno medicale. Come accade durante i temporali, una piccola percentuale d’ozono si genera allorché un flusso d’ossigeno medicale fluisce attraversa un elevato gradiente elettrico (da 5 a 13 megavolts) secondo la reazione:  3 O₂ + 68,400 cal ---- → 2 O₃.

Pertanto possiamo prelevare con una siringa ozono resistente il necessario volume di gas, che comprende almeno il 95% d’ossigeno e un massimo di 5% di ozono. Non possiamo usare aria perché questa, contenendo il 78% di azoto, permetterebbe anche la formazione di biossido di ozono (N₂O), estremamente tossico. Purtroppo, ancora oggi, generatori “economici” costruiti in alluminio, non ozono resistenti nel tempo subiscono una corrosione e, permettendo una contaminazione aerea, possono dar luogo alla formazione di una miscela tossica in parte responsabile delle morti osservate nel nostro Paese. L’ozono è, rispetto all’ossigeno, 1,6 volte più pesante e 10 volte più solubile nell’acqua (49.0 ml in 100 ml d’acqua a 0 °C), caratteristica importante per comprendere la rapidità delle reazioni. Sebbene l’ozono non sia una molecola radicalica (cioè con elettroni spaiati nell’orbita periferica), nella scala chimica degli ossidanti risulta al terzo posto dopo il fluoro e il persolfato. Dopo queste premesse, se vogliamo usare con sicurezza l’ozono in medicina, dobbiamo:

a) disporre di un generatore costruito con materiali ozono-resistenti e idonei a produrre precise concentrazioni di ozono (μg/ml di gas) misurabili in tempo reale mediante fotometria.

b) Prelevare accuratamente un volume di gas con la desiderata concentrazione d’ozono. La dose totale risulta dal prodotto della concentrazione di ozono per il volume del gas.

e) Conoscere la dose ottimale per ottenere l’effetto terapeutico senza alcuna tossicità.

d) Eseguire l’ozonoterapia in un ambulatorio idoneo, con tutte le misure di sicurezza previste dalla legge (distruttore di ozono, depuratore dell’aria per ogni emergenza). In tali condizioni non vi è alcun rischio per il paziente o il personale sanitario. Qual’è il comportamento e il destino dell’ozono in contatto del sangue ex vivo durante l’ozonizzazione?

Riassumerò i cinque concetti essenziali:

1) come ogni altro gas, l’ozono si discioglie completamente in circa 5 min nell’acqua purissima e raggiunge una concentrazione che corrisponde al 25% della concentrazione del gas in rapporto alla temperatura e alla pressione relativa dell’ozono. L’ozono disciolto nell’acqua è relativamente stabile per circa 24 ore e può essere utilizzato come un ottimo disinfettante per lesioni infette delle mucose (orale, vaginale, rettale, ecc.) e della cute.

2) D’altra parte, al contrario dell’ossigeno che, dopo una minima solubilizzazione nell’acqua plasmatica, satura solo l’emoglobina, parzialmente ossigenata, l’ozono, solubilizzato nel plasma, reagisce istantaneamente con varie biomolecole riducenti, cioè donatrici di elettroni (acidi grassi insaturi, PUFA, antiossidanti quali acido urico e ascorbico, tioli contenenti gruppi sulfidrilici, R-SH, particolarmente albumina) generando un atomo di ossigeno radicalico e molto reattivo: O₃ + Biomolecole ------ → O₂ + O'

Contrariamente agli erronei concetti che l’ozono venga assorbito dalle mucose ed entri nelle cellule, devo precisare che, dopo la suddetta reazione, l’ozono si è estinto e una parte delle molecole presenti nel plasma sono ossidate.

3) La reazione fondamentale:

RCH = CHR’ + O₃ + H₂O ------ → RCH = O + R’CH = O + H₂O₂

dimostra che l’ozono, reagendo con il doppio legame di un acidio grasso insaturo genera due molecole di aldeidi (definite come prodotti di ossidazione lipidica o lipid oxidation products, LOPs) e perossido di idrogeno, cioè la comune acqua ossigenata. Questo composto è un ossidante ma, pur non essendo una molecola radicalica, viene inclusa tra i prodotti reattivi dell’ossigeno (reactive oxigen species, ROS) che includono altre molecole quali l’anione superossido, O₂', il monossido di azoto, NO', l’acido ipocloroso, HOCl e la ione idrossile OH'. Quest’ultimo può formarsi in presenza di H₂O₂ e Fe++ tramite la reazione di Fenton e di H₂O₂ + O₂ con la reazione di Haber-Weiss. Potrebbe formarsi anche una minima quantità di ossigeno singoletto: ¹O₂, ma i ROS fondamentali per l’attivazione biologica sono il perossido di idrogeno e il monossido di azoto. Ovviamente la concentrazione dei ROS e dei LOPs dipende dalla capacità antiossidante del sangue e dalla dose di ozono, che deve essere perfettamente calibrata in modo da stimolare l’attività biologica senza minimamente ledere le cellule ematiche. Infatti, usando eccessive dosi di ozono, si possono osservare danni cellulari legati al possibile aumento dello ione idrossile, dell’acido ipocloroso e dell’anione perossinitrito (O= NOO -). È importante precisare che i ROS hanno una emivita brevissima: da 1x10 ^-9 sec per il radicale idrossile a un massimo di 1-2 sec per il perossido di idrogeno. Pertanto, quando il sangue entra in contatto ex vivo con la miscela gassosa ossigeno-ozono, i ROS si generano e scompaiono con estrema rapidità, mentre i LOPs sono molto più stabili (almeno in vitro) e rimangono attivi durante l’infusione del sangue nel donatore.

Poiché nel plasma è presente una miscela assai eterogenea di lipidi, il processo di perossidazione, sia quello naturale che quelle dovuto, all’ozono, comporta inevitabilmente la produzione di una miscela eterogenea di LOPs. Durante il processo di ozonizzazione del sangue, un’aliquota dell’ozono reagisce con gli acidi grassi insaturi presenti nel plasma (PUFA legati all’albumina o ai chilomicroni o alle lipoproteine) ed è inevitabile un transitorio aumento di lipoperossidi (LOO', lipoidroperossidi (LOOH), alchenali (particolarmente i 4-idrossi-alchenali), malonaldeide e F2- isoprostani. Poiché le aldeidi e/o le molecole radicaliche sono intrinsecamente aggressive e tossiche, la dose di ozono deve essere precisa e oculata in modo da generare la minima quantità dei LOPs. Tuttavia, durante la reinfusione del sangue ozonizzato, la loro tossicità non solo è minimizzata dalla loro diluizione in circa 15 litri di liquidi biologici, ma dalla contemporanea inattivazione enzimatica (a opera delle GSH-transferasi, GSH-Tr e aldeide-deidrogenasi) e dall’escrezione tramite la bile e l’urina. Abbiamo accertato che questi processi protettivi in breve tempo riducono i LOPs a livelli submicromolari ma sempre utili perché raggiungendo ogni organo, significativamente il midollo osseo, il fegato e il sistema neuroendocrino, informano le cellule che il trattamento terapeutico, equivalente a un calcolato stress ossidativo acuto, richiede la pronta attivazione del sistema difensivo. Questa interessante farmacocinetica comporta un rapido aumento della sintesi degli enzimi antiossidanti (catalasi, superossido-dismutasi, SOD, GSH-perossidasi, ecc.) e l’induzione delle proteine da stress, una delle quali è l’emeossigenasi I. Quest’enzima ha un grande valore protettivo potendo incrementare i livelli locali di CO (che coadiua l’ossido nitrico nella vasodilatazione) e di bilirubina (antiossidante lipofilo, che, al pari della vitamina E, interrompe la ossidazione lipidica).

4) A prima vista e almeno concettualmente, lo stress ossidativo acuto indotto dall’ozono sembrerebbe dannoso ma, con ben dosate concentrazioni, possiamo realizzarlo in modo adeguato e tale da suscitare una risposta biologica utile senza effetti tossici. Questo processo appare paradossale perché un potente ossidante come l’ozono è in grado di stimolare un aumento delle capacità antiossidanti e difensive dell’organismo. Questo meraviglioso fenomeno avviene sia nel mondo animale che vegetale e prende il nome di tolleranza all’ozono o meglio di adattamento allo stress ossidativo. Abbiamo già ottenuto molti dati sperimentali e clinici che convalidano questo concetto, già intuito da Paracelso (Philipp Theophrast von Hohenhein, 1493-1541) e scientificamente dimostrato da Ritossa nel 1962 nella Drosophila mediante brevi e calcolati stress termici.

5) La concentrazione di ozono, e comunque la dose, deve rientrare entro la “finestra terapeutica" che, dopo ampia sperimentazione è ora ben definita tra 10 e 80 μg/ml di gas per ml di sangue e deve essere selezionata per il tipo di patologia, la fase della malattia, l’età, il peso corporeo e la situazione metabolica del/la paziente. Appare quasi ovvio che una dose inferiore ai 5-10 μg/ml possa risultare inutile perché l’ozono, totalmente neutralizzato dagli antiossidanti plasmatici, non riesce a indurre una sufficiente ossidazione e quindi una produzione di messaggeri. In tal caso il trattamento può solo procurare un effetto placebo. Una dose superiore agli 80 μg/ml potrebbe, pur con la variabilità individuale della capacità antiossidante, essere dannosa, un fatto rapidamente verificabile misurando l’eventuale rilascio di emoglobina e accertando se il paziente ha notato una sintomatologia particolare (astenia e sonnolenza post-trattamento). Idealmente la dose ottima è quella che ottiene il massimo effetto biologico e terapeutico senza effetti collaterali. Una razionale strategia che usiamo da anni è quella di iniziare con bassi dosaggi (circa 20 μg/m1) e lentamente, basandosi sulla reattività e la risposta dei paziente, e di aumentare progressivamente la dose ogni settimana fino a raggiungere la dose nota come idonea per una particolare patologia.

Gli affetti biologici indotti dai Ros e Lops

Anche se l’ozono è somministrato in modi diversi, i liquidi biologici (plasma, liquido interstiziale, liquido sinoviale e liquidi mucosali) rappresentano la fase critica ove entrambi, l’ossigeno e l’ozono, inizialmente devono disciogliersi in base alle leggi dei gas. La differenza sostanziale è che l’ossigeno può equilibrarsi e diffondere anche attraverso vari strati cellulari, mentre l’ozono reagisce istantaneamente sia con i PUFA, sia con una miriade di composti idrofili (acido urico, acido ascorbico, glutatione ridotto, GSH, cisteina, ecc.) e lipofili (Vitamina E, β-caroteni, bilirubina ecc) che, cedendo elettroni, neutralizzano più o meno completamente la dose di ozono. In altri termini, solo usando dosi entro l’ambito terapeutico, l’ozono potrà generare una concentrazione di ROS e LOPs ben rapportabili alla dose e alla capacità antiossidante dei substrati. Abbiamo già menzionato che l’azione dei composti generati dall’ozono può distinguersi in due fasi: la prima è dovuta ai ROS che si estinguono con estrema rapidità. Il composto più rilevante è il perossido di idrogeno, che aumenta istantaneamente nel plasma ed essendo un composto non ionizzato, oltrepassa agevolmente le membrane cellulari e penetra nel citoplasma delle cellule ematiche. La determinazione del gradiente di concentrazione tra plasma e liquido citoplasmatico ha precisato che la quantità intracellulare di H₂O₂ scende al 10%: è sufficiente una minima concentrazione (normalmente di alcune micromoli), per attivare simultaneamente alcuni fondamentali processi biochimici negli eritrociti, leucociti e piastrine. Questi processi sono ben regolati dalla concentrazione intracellulare di antiossidanti, quali GSH ed enzimi (catalasi e GSH-perossidasi, GSH-Px), che bloccano potenziali danni ossidativi a enzimi e acidi nucleici. Si deve notare che il perossido di idrogeno è legato a una produzione ESOCENA TRANSITORIA connessa alla dose di ozono, di brevissima durata e ben diversa da una produzione ENDOGENA PERMANENTE realizzata durante un aumento patologico del processo ossidativo.

Il plasma e i liquidi interstiziali rappresentano i compartimenti contenenti le biomolecole che, per prime, reagiscono ed esauriscono la dose di ozono. In rapporto a questa ed entro un minuto si è potuto determinare una modesta riduzione (dal 12% al 25%) della capacità antiossidante del plasma, seguita dalla sua rapida (entro i successivi 20 min) reintegrazione totale dovuta all’efficienza dei sistemi riducenti intracellulari.

Un contributo importante nel determinare la riduzione del deidroascorbato ad ascorbato usando GSH (in circa 3 min) è dovuto alle ricerche pubblicate da May et al.,(1996) e da Mendiratta et al., (1998). Negli eritrociti, la subitanea ossidazione del GSH (con conseguente riduzione di H₂O₂ ad acqua) comporta un transitorio squilibrio del rapporto GSH/GSSG che viene rapidamente corretto sia dalla riduzione del GSSG tramite la GSH-reduttasi (GSH→Rd) e la pronta utilizzazione del NADPH continuamente rifornito dall’ossidazione del glucosio-6-fosfato (G6P) nelle prime due tappe dello shunt dei pentosi, di cui la glucosico-6-fosfatodeidrogenasi (G6PDH) è l’enzima chiave. Questa serie di interazioni biochimiche favorisce un aumento della glicolisi, un’aumentata disponibilità di ATP, NADPH e probabilmente, anche se questo aspetto non è ancora ben definito, di 2,3 difosfoglicerato. Lo spostamento a destra della curva di dissociazione dell’ossiemoglobina comporta un aumentato rilascio di ossigeno nei tessuti ischemici. Usando l’ozono entro il prestabilito ambito terapeutico, esso non reagisce con i fosfolipidi delle membrane eritrocitarie, che rimangono integre. Infatti l’emolisi oscilla tra 0,2 e 0,5 % e i livelli di metemoglobina, K+ e degli enzimi intracellulari rimangono costanti. In questa situazione è molto improbabile che gli eritrociti rilascino Fe++, che potrebbe catalizzare la formazione del temibile radicale idrossile.

Nei leucociti, l’ozonizzazione del sangue stimola l’attività fagocitaria dei neutrofili, mentre nei linfociti, anche il minimo ingresso intracitoplasmatico del perossido d’idrogeno attiva due (tirosina)-proteinchinasi con la conseguente fosforilazione di una proteina (IkB). Questa, dissociandosi dal complesso trimerico NFkB, permette all’eterodimero p50-p65 di spostarsi nel nucleo e legarsi a siti specifici del DNA per regolare l’espressione di molti geni. L’acronimo definito “fattore nucleare kB” dagli scopritori Sen e Baltimore (1986), uno tra i più importanti fattori di trascrizione, è modulato sia dal GSH e altri composti riducenti che dal perossido di idrogeno, responsabile della produzione di numerose citochine (Interleuchine-1, 2, 6, 8, 15, Interferone-ß, TNF-alfa) aventi un ruolo fondamentale nelle risposte immunitarie e infiammatorie. Questo processo, seppure riferito qui nelle linee essenziali, ha permesso di comprendere come l’ozonizzazione del sangue, inducendo, un transitorio incremento di H₂O₂ intracellulare, potesse spiegare l’importante azione immunomodulante dell’ozono. Questa fu la prima idea che ci spinse a investigare le azioni biologiche dell’ozono. Sebbene questo gas, rispetto ai classici mitogeni, sia un debole induttore, la sua azione risulta potenziata dalla ripetizione dei trattamenti, ciò perché i linfociti attivati ex vivo, rientrando dopo la reinfusione del sangue nei microambienti linfoidi, iniziano a rilasciare in vivo le citochine, le quali attivano altri linfociti (effetto priming) con il risultato di una progressiva amplificazione immunitaria. Questo lento processo, capace di immunomodulare la produzione fisiologica di numerose citochine, risulta scevro di effetti collaterali rispetto alla somministrazione esogena di TNFα, Il-2 e Il-12 (Fig. 1).

Nelle piastrine, dosi oculate di ozono e quindi di ROS favoriscono il moderato rilascio di ATP e di fattori di crescita quali PDGP (platelet derived growth factor) TGF-β (transforming growth factor beta), bFGF (basic fibroblast growth factor), HGF (hepatocyte growth factor), EGF (epidermal growth factor) e VEGF (vascular endothelial growth factor), tutti molto importanti e in grado di spiegare perché il trattamento parenterale con ozonoterapia e locale con olio ozonizzato di ulcere croniche, nei diabetici e nei pazienti con arteriosclerosi, permette un miglioramento della vascolarizzazione e la rapida cicatrizzazione delle ulcere.  

La prima fase di attivazione dovuta ai ROS si è quindi rapidamente conclusa ex vivo ma i LOPs sono rimasti attivi e a loro spetta la seconda fase di attivazione in vivo, allorché il sangue ozonizzato viene reinfuso e rientra nella circolazione generale.  

Valutiamo ora brevemente gli effetti biologici dei LOPs. È facile immaginare come questi composti diffusibili, durante i 15 -20 min della reinfusione, entrino innanzitutto in contatto con la vasta superficie del letto endoteliale e, dopo avere oltrepassato i capillari, si diluiscano nel liquido interstiziale e prendono contatto con le cellule dell’organismo (Fig.2).

Questa è una fase meravigliosa perché l’ozono, pur essendo scomparso in brevissimo tempo ex vivo, continua a trasmettere una varietà di segnali nei più reconditi recessi tessutali. Mi pare utile enfatizzare che i LOPs, molecole potenzialmente tossiche, grazie all’enorme diluizione, parziale neutralizzazione ed escrezione, diventano dei messaggeri cruciali capaci di informare le cellule che l’intero organismo è ora sottoposto a ripetuti e ben graduati stress ossidativi acuti. Paracelso aveva idealizzato il concetto di uno “spirito vitale rinnovatore" (Archeus) ma non poté concretizzarlo nel XVI secolo. L’uso giudizioso dell’ozono nel XXI secolo ci permette di realizzare un sogno nebuloso in una realtà scientifica e ciò in virtù di un numero di composti chimici, che legandosi ai recettori cellulari e reagendo con altrettanto precisi processi metabolici, possono riattivare o normalizzare la vita cellulare. L’endotelio, che è ormai diventato un vero organo, interagendo con i LOPs, per attivazione della NO sintetasi, accentua il rilascio dei vasodilatatori: NO^. e nitrosotioli, che sono i composti fondamentali nella regolazione del tono vascolare. È quasi superfluo sottolineare la rilevanza del sinergismo operaio da NO e CO nelle vasculopatie ischemiche ove l’ozonoterapia può avere un ruolo insostituibile rispetto ai farmaci convenzionali (pentossifillina, analoghi della prostaciclina, anti-aggreganti piastrinici). 

I LOPs sembrano agire come i classici ormoni, vale a dire operano a lunga distanza e il midollo osseo ne è la prova almeno indiretta. Durante i cicli terapeutici basati sul trattamento di autoemoterapia bisettimanale in centinaia di pazienti con diverse patologie (maculopatia degenerativa dell’anziano o age-related macular degeneration, ARMD, gravi ischemie al III e IV stadio degli arti inferiori), quando possibile, abbiamo prelevato campioni di sangue prima, durante e al termine della terapia per esaminare l’attività di alcuni enzimi antiossidanti negli eritrociti. Questi ultimi si rinnovano ogni 4 mesi e, pur evitando la biopsia midollare, ci permettono di valutare se la regolazione della sintesi degli enzimi si modifica durante l’eritrogenesi. Abbiamo determinato che dopo 13-16 trattamenti, le attività enzimatiche della GSH- Px, GSH-Rd, GSH-Tr e della SOD erano aumentate del 210, 147, 164 e 141 %, indicando che i precisi stress ossidativi acuti indotti dalla terapia erano stati recepiti durante la maturazione e differenziazione degli eritroblasti. Queste percentuali sono relativamente elevate, ma si deve considerare che le determinazioni sono state eseguite su tutta la popolazione eritrocitaria, che contiene solo una frazione degli eritrociti giovani.

Questi dati sono stati convalidati dopo l’isolamento della frazione eritrocitaria giovane ove abbiamo determinato un netto aumento della glucosio-6-PD, l’enzima chiave del ciclo dei pentosi. Il fenomeno dell’induzione dell’adattamento allo stress ossidativo, seppure apparentemente paradossale, ha grande rilevanza e, come ho gia menzionato, è stato rilevato sia nei pazienti, sia nei ratti, che nei batteri e perfino nelle piante sottoposte a piccoli ma frequenti stress ossidativi da ozono. Murry et al. furono i primi, nel 1986, a suggerire il concetto di “condizionamento all’ischemia” dopo aver praticato brevi periodi di ischemia cardiaca capaci di aumentare successivamente la resistenza ad un infarto potenzialmente letale. È evidente che stress ripetuti, se di minima intensità, permettono all’organismo di superare un evento grave, potenzialmente mortale. Non abbiamo mai notato un aumento dell’eritropoiesi e, in realtà, aumentando l’ossigenazione tessutale, non era ipotizzabile un aumento della secrezione di eritropoietina. Poniamo invece molta attenzione a un possibile aumento del rilascio di cellule staminali, ipotesi razionalmente sostenibile dall’aumentata sintesi di NO, che, a livello midollare, può attivare la metalloproteinasi-9. Se questa ipotesi potesse avverarsi, l’ozonoterapia diventerebbe un cardine terapeutico dopo un infarto miocardio o cerebrale, o nell’ischemia degli arti inferiori.

Pur avendo cercato di esaminare il problema, non siamo ancora riusciti a chiarire la rilevanza dei LOPs per quanto riguarda il sistema nervoso centrale e il sistema endocrino. La maggioranza dei pazienti sotto giudizioso trattamento di ozonoterapia, non solo non ha mai riportato fenomeni tossici acuti o cronici ma, sorprendentemente, godono di una maggiore energia (probabilmente legata a una migliorata ossigenazione) e di un senso di benessere ed euforia. È ragionevole ipotizzare una stimolazione neuroendocrina successiva all’infusione del sangue ozonizzato e non sarei sorpreso, quando potremo eseguire questo studio, di riscontrare un aumento dei livelli plasmatici di cortisolo, ormone somatotropo e forse anche del deidroepiandrosterone. Più difficile sarà invece chiarire la rilevanza delle endorfine e di alcuni neurotrasmettitori. Anche se la prima fase (ROS) ex vivo sembra disgiunta dalla seconda fase (LOPs) in vivo, in realtà esse esprimono un processo continuo iniziato dall’ozono e continuato dalla cascata dei vari composti chimici responsabili delle reazioni cellulari.