LĠossigeno-ozono terapia nel
2005
Tratto da Medicina Naturale nĦ 4 - Luglio 2005
di Velio Bocci, MD, Universit di Siena
LĠutilizzo
ottimale dellĠozono
LĠozono costituito da una molecola con tre atomi di
ossigeno in una struttura ciclica e instabile tanto da avere una breve emivita
(40 min a +20 ĦC) per cui deve essere preparato e usato estemporaneamente
utilizzando ossigeno medicale. Come accade durante i temporali, una piccola
percentuale dĠozono si genera allorch un flusso dĠossigeno medicale fluisce
attraversa un elevato gradiente elettrico (da 5 a 13 megavolts) secondo la
reazione: 3 O2 + 68,400 cal ---- → 2 O3.
Pertanto possiamo prelevare con una siringa ozono
resistente il necessario volume di gas, che comprende almeno il 95% dĠossigeno
e un massimo di 5% di ozono. Non possiamo usare aria perch questa, contenendo
il 78% di azoto, permetterebbe anche la formazione di biossido di ozono (N2O),
estremamente tossico. Purtroppo, ancora oggi, generatori ÒeconomiciÓ costruiti
in alluminio, non ozono resistenti nel tempo subiscono una corrosione e,
permettendo una contaminazione aerea, possono dar luogo alla formazione di una
miscela tossica in parte responsabile delle morti osservate nel nostro Paese. LĠozono
, rispetto allĠossigeno, 1,6 volte pi pesante e 10 volte pi solubile
nellĠacqua (49.0 ml in 100 ml dĠacqua a 0 ĦC), caratteristica importante per
comprendere la rapidit delle reazioni. Sebbene lĠozono non sia una molecola
radicalica (cio con elettroni spaiati nellĠorbita periferica), nella scala
chimica degli ossidanti risulta al terzo posto dopo il fluoro e il persolfato.
Dopo queste premesse, se vogliamo usare con sicurezza lĠozono in medicina,
dobbiamo:
a) disporre di un generatore costruito con materiali
ozono-resistenti e idonei a produrre precise concentrazioni di ozono (μg/ml di
gas) misurabili in tempo reale mediante fotometria.
b)
Prelevare accuratamente un volume di gas con la desiderata concentrazione
dĠozono. La dose totale risulta dal prodotto della concentrazione di ozono per
il volume del gas.
e) Conoscere la dose ottimale per ottenere lĠeffetto
terapeutico senza alcuna tossicit.
d)
Eseguire lĠozonoterapia in un ambulatorio idoneo, con tutte le misure di
sicurezza previste dalla legge (distruttore di ozono, depuratore dellĠaria per
ogni emergenza). In tali condizioni non vi alcun rischio per il paziente o il
personale sanitario. QualĠ il comportamento e il destino dellĠozono in
contatto del sangue ex vivo durante lĠozonizzazione?
Riassumer
i cinque concetti essenziali:
1) come
ogni altro gas, lĠozono si discioglie completamente in circa 5 min nellĠacqua
purissima e raggiunge una concentrazione che corrisponde al 25% della
concentrazione del gas in rapporto alla temperatura e alla pressione relativa
dellĠozono. LĠozono disciolto nellĠacqua relativamente stabile per circa 24
ore e pu essere utilizzato come un ottimo disinfettante per lesioni infette
delle mucose (orale, vaginale, rettale, ecc.) e della cute.
2) DĠaltra parte, al contrario dellĠossigeno che,
dopo una minima solubilizzazione nellĠacqua plasmatica, satura solo
lĠemoglobina, parzialmente ossigenata, lĠozono, solubilizzato nel plasma,
reagisce istantaneamente con varie biomolecole riducenti, cio donatrici di
elettroni (acidi grassi insaturi, PUFA, antiossidanti quali acido urico e
ascorbico, tioli contenenti gruppi sulfidrilici, R-SH, particolarmente
albumina) generando un atomo di ossigeno radicalico e molto reattivo: O3
+ Biomolecole ------ → O2 + O'
Contrariamente
agli erronei concetti che lĠozono venga assorbito dalle mucose ed entri nelle
cellule, devo precisare che, dopo la suddetta reazione, lĠozono si estinto e
una parte delle molecole presenti nel plasma sono ossidate.
3) La
reazione fondamentale:
RCH = CHRĠ + O3 + H2O ------ → RCH = O + RĠCH = O + H2O2
dimostra che lĠozono, reagendo con il doppio legame
di un acidio grasso insaturo genera due molecole di aldeidi (definite come
prodotti di ossidazione lipidica o lipid oxidation products, LOPs) e perossido
di idrogeno, cio la comune acqua ossigenata. Questo composto un ossidante
ma, pur non essendo una molecola radicalica, viene inclusa tra i prodotti
reattivi dellĠossigeno (reactive oxigen species, ROS) che includono altre
molecole quali lĠanione superossido, O2', il monossido di azoto,
NO', lĠacido ipocloroso, HOCl e la ione idrossile OH'. QuestĠultimo pu
formarsi in presenza di H2O2 e Fe++ tramite la reazione
di Fenton e di H2O2 + O2 con la reazione di
Haber-Weiss. Potrebbe formarsi anche una minima quantit di ossigeno
singoletto: 1O2, ma i ROS fondamentali per lĠattivazione
biologica sono il perossido di idrogeno e il monossido di azoto. Ovviamente la
concentrazione dei ROS e dei LOPs dipende dalla capacit antiossidante del
sangue e dalla dose di ozono, che deve essere perfettamente calibrata in modo
da stimolare lĠattivit biologica senza minimamente ledere le cellule ematiche.
Infatti, usando eccessive dosi di ozono, si possono osservare danni cellulari
legati al possibile aumento dello ione idrossile, dellĠacido ipocloroso e
dellĠanione perossinitrito (O= NOO -). é importante precisare che i ROS hanno
una emivita brevissima: da 1x10 -9 sec per il radicale idrossile a
un massimo di 1-2 sec per il perossido di idrogeno. Pertanto, quando il sangue
entra in contatto ex vivo con la miscela gassosa ossigeno-ozono, i ROS si
generano e scompaiono con estrema rapidit, mentre i LOPs sono molto pi
stabili (almeno in vitro) e rimangono attivi durante lĠinfusione del sangue nel
donatore.
Poich nel plasma presente una miscela assai
eterogenea di lipidi, il processo di perossidazione, sia quello naturale che
quelle dovuto, allĠozono, comporta inevitabilmente la produzione di una miscela
eterogenea di LOPs. Durante il processo di ozonizzazione del sangue, unĠaliquota
dellĠozono reagisce con gli acidi grassi insaturi presenti nel plasma (PUFA
legati allĠalbumina o ai chilomicroni o alle lipoproteine) ed inevitabile un
transitorio aumento di lipoperossidi (LOO', lipoidroperossidi (LOOH), alchenali
(particolarmente i 4-idrossi-alchenali), malonaldeide e F2- isoprostani. Poich
le aldeidi e/o le molecole radicaliche sono intrinsecamente aggressive e
tossiche, la dose di ozono deve essere precisa e oculata in modo da generare la
minima quantit dei LOPs. Tuttavia, durante la reinfusione del sangue
ozonizzato, la loro tossicit non solo minimizzata dalla loro diluizione in
circa 15 litri di liquidi biologici, ma dalla contemporanea inattivazione
enzimatica (a opera delle GSH-transferasi, GSH-Tr e aldeide-deidrogenasi) e dallĠescrezione
tramite la bile e lĠurina. Abbiamo accertato che questi processi protettivi in
breve tempo riducono i LOPs a livelli submicromolari ma sempre utili perch
raggiungendo ogni organo, significativamente il midollo osseo, il fegato e il
sistema neuroendocrino, informano le cellule che il trattamento terapeutico,
equivalente a un calcolato stress ossidativo acuto, richiede la pronta
attivazione del sistema difensivo. Questa interessante farmacocinetica comporta
un rapido aumento della sintesi degli enzimi antiossidanti (catalasi,
superossido-dismutasi, SOD, GSH-perossidasi, ecc.) e lĠinduzione delle proteine
da stress, una delle quali lĠemeossigenasi I. QuestĠenzima ha un grande
valore protettivo potendo incrementare i livelli locali di CO (che coadiua
lĠossido nitrico nella vasodilatazione) e di bilirubina (antiossidante
lipofilo, che, al pari della vitamina E, interrompe la ossidazione lipidica).
4) A prima vista e almeno concettualmente, lo stress
ossidativo acuto indotto dallĠozono sembrerebbe dannoso ma, con ben dosate
concentrazioni, possiamo realizzarlo in modo adeguato e tale da suscitare una
risposta biologica utile senza effetti tossici. Questo processo appare
paradossale perch un potente ossidante come lĠozono in grado di stimolare un
aumento delle capacit antiossidanti e difensive dellĠorganismo. Questo
meraviglioso fenomeno avviene sia nel mondo animale che vegetale e prende il
nome di tolleranza allĠozono o meglio di adattamento allo stress ossidativo.
Abbiamo gi ottenuto molti dati sperimentali e clinici che convalidano questo
concetto, gi intuito da Paracelso (Philipp Theophrast von Hohenhein,
1493-1541) e scientificamente dimostrato da Ritossa nel 1962 nella Drosophila
mediante brevi e calcolati stress termici.
5) La
concentrazione di ozono, e comunque la dose, deve rientrare entro la Òfinestra
terapeutica" che, dopo ampia sperimentazione ora ben definita tra 10 e
80 μg/ml di gas per ml di sangue e deve essere selezionata per il tipo di
patologia, la fase della malattia, lĠet, il peso corporeo e la situazione
metabolica del/la paziente. Appare quasi ovvio che una dose inferiore ai 5-10 μg/ml possa
risultare inutile perch lĠozono, totalmente neutralizzato dagli antiossidanti
plasmatici, non riesce a indurre una sufficiente ossidazione e quindi una
produzione di messaggeri. In tal caso il trattamento pu solo procurare un
effetto placebo. Una dose superiore agli 80 μg/ml potrebbe, pur con la variabilit
individuale della capacit antiossidante, essere dannosa, un fatto rapidamente
verificabile misurando lĠeventuale rilascio di emoglobina e accertando se il
paziente ha notato una sintomatologia particolare (astenia e sonnolenza
post-trattamento). Idealmente la dose ottima quella che ottiene il massimo
effetto biologico e terapeutico senza effetti collaterali. Una razionale
strategia che usiamo da anni quella di iniziare con bassi dosaggi (circa 20 μg/m1) e
lentamente, basandosi sulla reattivit e la risposta dei paziente, e di
aumentare progressivamente la dose ogni settimana fino a raggiungere la dose
nota come idonea per una particolare patologia.
Gli
affetti biologici indotti dai Ros e Lops
Anche se lĠozono somministrato in modi diversi, i
liquidi biologici (plasma, liquido interstiziale, liquido sinoviale e liquidi mucosali)
rappresentano la fase critica ove entrambi, lĠossigeno e lĠozono, inizialmente
devono disciogliersi in base alle leggi dei gas. La differenza sostanziale
che lĠossigeno pu equilibrarsi e diffondere anche attraverso vari strati
cellulari, mentre lĠozono reagisce istantaneamente sia con i PUFA, sia con una
miriade di composti idrofili (acido urico, acido ascorbico, glutatione ridotto,
GSH, cisteina, ecc.) e lipofili (Vitamina E, β-caroteni, bilirubina ecc) che, cedendo
elettroni, neutralizzano pi o meno completamente la dose di ozono. In altri
termini, solo usando dosi entro lĠambito terapeutico, lĠozono potr generare
una concentrazione di ROS e LOPs ben rapportabili alla dose e alla capacit
antiossidante dei substrati. Abbiamo gi menzionato che lĠazione dei composti
generati dallĠozono pu distinguersi in due fasi: la prima dovuta ai ROS che
si estinguono con estrema rapidit. Il composto pi rilevante il perossido di
idrogeno, che aumenta istantaneamente nel plasma ed essendo un composto non
ionizzato, oltrepassa agevolmente le membrane cellulari e penetra nel
citoplasma delle cellule ematiche. La determinazione del gradiente di
concentrazione tra plasma e liquido citoplasmatico ha precisato che la quantit intracellulare di H2O2
scende al 10%: sufficiente una minima concentrazione (normalmente di alcune
micromoli), per attivare simultaneamente alcuni fondamentali processi
biochimici negli eritrociti, leucociti e piastrine. Questi processi sono ben
regolati dalla concentrazione intracellulare di antiossidanti, quali GSH ed
enzimi (catalasi e GSH-perossidasi, GSH-Px), che bloccano potenziali danni
ossidativi a enzimi e acidi nucleici. Si deve notare che il perossido di
idrogeno legato a una produzione ESOCENA TRANSITORIA connessa alla dose di
ozono, di brevissima durata e ben diversa da una produzione ENDOGENA PERMANENTE
realizzata durante un aumento patologico del processo ossidativo.
Il plasma e i liquidi interstiziali rappresentano i
compartimenti contenenti le biomolecole che, per prime, reagiscono ed
esauriscono la dose di ozono. In rapporto a questa ed entro un minuto si
potuto determinare una modesta riduzione (dal 12% al 25%) della capacit
antiossidante del plasma, seguita dalla sua rapida (entro i successivi 20 min)
reintegrazione totale dovuta allĠefficienza dei sistemi riducenti
intracellulari.
Un contributo importante nel determinare la
riduzione del deidroascorbato ad ascorbato usando GSH (in circa 3 min) dovuto
alle ricerche pubblicate da May et al.,(1996) e da Mendiratta et al., (1998).
Negli eritrociti, la subitanea ossidazione del GSH (con conseguente riduzione
di H2O2 ad acqua) comporta un transitorio squilibrio del
rapporto GSH/GSSG che viene rapidamente corretto sia dalla riduzione del GSSG
tramite la GSH-reduttasi (GSH→Rd) e la pronta utilizzazione del NADPH
continuamente rifornito dallĠossidazione del glucosio-6-fosfato (G6P) nelle
prime due tappe dello shunt dei pentosi, di cui la
glucosico-6-fosfatodeidrogenasi (G6PDH) lĠenzima chiave. Questa serie di
interazioni biochimiche favorisce un aumento della glicolisi, unĠaumentata
disponibilit di ATP, NADPH e probabilmente, anche se questo aspetto non
ancora ben definito, di 2,3 difosfoglicerato. Lo spostamento a destra
della curva di dissociazione dellĠossiemoglobina comporta un aumentato rilascio
di ossigeno nei tessuti ischemici. Usando lĠozono entro il prestabilito ambito
terapeutico, esso non reagisce con i fosfolipidi delle membrane eritrocitarie,
che rimangono integre. Infatti lĠemolisi oscilla tra 0,2 e 0,5 % e i livelli di
metemoglobina, K+ e degli enzimi intracellulari rimangono costanti. In questa
situazione molto improbabile che gli eritrociti rilascino Fe++, che potrebbe
catalizzare la formazione del temibile radicale idrossile.
Nei leucociti, lĠozonizzazione del sangue stimola
lĠattivit fagocitaria dei neutrofili, mentre nei linfociti, anche il minimo
ingresso intracitoplasmatico del perossido dĠidrogeno attiva due
(tirosina)-proteinchinasi con la conseguente fosforilazione di una
proteina (IkB). Questa, dissociandosi dal complesso trimerico NFkB, permette
allĠeterodimero p50-p65 di spostarsi nel nucleo e legarsi a siti specifici del
DNA per regolare lĠespressione di molti geni. LĠacronimo definito Òfattore
nucleare kBÓ dagli scopritori Sen e Baltimore (1986), uno tra i pi
importanti fattori di trascrizione, modulato sia dal GSH e altri composti
riducenti che dal perossido di idrogeno, responsabile della produzione di
numerose citochine (Interleuchine-1, 2, 6, 8, 15, Interferone-§, TNF-alfa)
aventi un ruolo fondamentale nelle risposte immunitarie e infiammatorie. Questo
processo, seppure riferito qui nelle linee essenziali, ha permesso di
comprendere come lĠozonizzazione del sangue, inducendo, un transitorio
incremento di H2O2 intracellulare, potesse spiegare
lĠimportante azione immunomodulante dellĠozono. Questa fu la prima idea che ci
spinse a investigare le azioni biologiche dellĠozono. Sebbene questo gas,
rispetto ai classici mitogeni, sia un debole induttore, la sua azione risulta
potenziata dalla ripetizione dei trattamenti, ci perch i linfociti attivati
ex vivo, rientrando dopo la reinfusione del sangue nei microambienti linfoidi,
iniziano a rilasciare in vivo le citochine, le quali attivano altri linfociti
(effetto priming) con il risultato di una progressiva amplificazione
immunitaria. Questo lento processo, capace di immunomodulare la produzione
fisiologica di numerose citochine, risulta scevro di effetti collaterali
rispetto alla somministrazione esogena di TNFα, Il-2 e Il-12 (Fig. 1).
Nelle piastrine, dosi oculate di ozono e quindi di
ROS favoriscono il moderato rilascio di ATP e di fattori di crescita quali PDGP
(platelet derived growth factor) TGF-β (transforming growth factor beta), bFGF
(basic fibroblast growth factor), HGF (hepatocyte growth factor), EGF
(epidermal growth factor) e VEGF (vascular endothelial growth factor), tutti
molto importanti e in grado di spiegare perch il trattamento parenterale con
ozonoterapia e locale con olio ozonizzato di ulcere croniche, nei diabetici e
nei pazienti con arteriosclerosi, permette un miglioramento della
vascolarizzazione e la rapida cicatrizzazione delle ulcere.
La prima fase di attivazione dovuta ai ROS si
quindi rapidamente conclusa ex vivo ma i LOPs sono rimasti attivi e a loro spetta
la seconda fase di attivazione in vivo, allorch il sangue ozonizzato viene
reinfuso e rientra nella circolazione generale.
Valutiamo ora brevemente gli effetti biologici dei
LOPs. é facile immaginare come questi composti diffusibili, durante i 15 -20
min della reinfusione, entrino innanzitutto in contatto con la vasta superficie
del letto endoteliale e, dopo avere oltrepassato i capillari, si diluiscano nel
liquido interstiziale e prendono contatto con le cellule dellĠorganismo (Fig.2).
Questa una fase meravigliosa perch lĠozono, pur
essendo scomparso in brevissimo tempo ex vivo, continua a trasmettere una
variet di segnali nei pi reconditi recessi tessutali. Mi pare utile
enfatizzare che i LOPs, molecole potenzialmente tossiche, grazie allĠenorme
diluizione, parziale neutralizzazione ed escrezione, diventano dei messaggeri
cruciali capaci di informare le cellule che lĠintero organismo ora sottoposto
a ripetuti e ben graduati stress ossidativi acuti. Paracelso aveva idealizzato
il concetto di uno Òspirito vitale rinnovatore" (Archeus) ma non pot
concretizzarlo nel XVI secolo. LĠuso giudizioso dellĠozono nel XXI secolo ci
permette di realizzare un sogno nebuloso in una realt scientifica e ci in
virt di un numero di composti chimici, che legandosi ai recettori cellulari e
reagendo con altrettanto precisi processi metabolici, possono riattivare o
normalizzare la vita cellulare. LĠendotelio, che ormai diventato un vero
organo, interagendo con i LOPs, per attivazione della NO sintetasi, accentua il
rilascio dei vasodilatatori: NO. e nitrosotioli, che sono i composti
fondamentali nella regolazione del tono vascolare. é quasi superfluo
sottolineare la rilevanza del sinergismo operaio da NO e CO nelle vasculopatie
ischemiche ove lĠozonoterapia pu avere un ruolo insostituibile rispetto ai
farmaci convenzionali (pentossifillina, analoghi della prostaciclina,
anti-aggreganti piastrinici).
I LOPs
sembrano agire come i classici ormoni, vale a dire operano a lunga distanza e
il midollo osseo ne la prova almeno indiretta. Durante i cicli terapeutici
basati sul trattamento di autoemoterapia bisettimanale in centinaia di pazienti
con diverse patologie (maculopatia degenerativa dellĠanziano o age-related
macular degeneration, ARMD, gravi ischemie al III e IV stadio degli arti
inferiori), quando possibile, abbiamo prelevato campioni di sangue prima,
durante e al termine della terapia per esaminare lĠattivit di alcuni enzimi
antiossidanti negli eritrociti. Questi ultimi si rinnovano ogni 4 mesi e, pur
evitando la biopsia midollare, ci permettono di valutare se la regolazione
della sintesi degli enzimi si modifica durante lĠeritrogenesi. Abbiamo
determinato che dopo 13-16 trattamenti, le attivit enzimatiche della GSH- Px,
GSH-Rd, GSH-Tr e della SOD erano aumentate del 210, 147, 164 e 141 %, indicando
che i precisi stress ossidativi acuti indotti dalla terapia erano stati
recepiti durante la maturazione e differenziazione degli eritroblasti. Queste
percentuali sono relativamente elevate, ma si deve considerare che le
determinazioni sono state eseguite su tutta la popolazione eritrocitaria, che
contiene solo una frazione degli eritrociti giovani.
Questi dati sono stati convalidati dopo lĠisolamento
della frazione eritrocitaria giovane ove abbiamo determinato un netto aumento
della glucosio-6-PD, lĠenzima chiave del ciclo dei pentosi. Il fenomeno
dellĠinduzione dellĠadattamento allo stress ossidativo, seppure apparentemente
paradossale, ha grande rilevanza e, come ho gia menzionato, stato rilevato
sia nei pazienti, sia nei ratti, che nei batteri e perfino nelle piante
sottoposte a piccoli ma frequenti stress ossidativi da ozono. Murry et al.
furono i primi, nel 1986, a suggerire il concetto di Òcondizionamento
allĠischemiaÓ dopo aver praticato brevi periodi di ischemia cardiaca capaci di
aumentare successivamente la resistenza ad un infarto potenzialmente letale. é
evidente che stress ripetuti, se di minima intensit, permettono allĠorganismo
di superare un evento grave, potenzialmente mortale. Non abbiamo mai notato un
aumento dellĠeritropoiesi e, in realt, aumentando lĠossigenazione tessutale,
non era ipotizzabile un aumento della secrezione di eritropoietina. Poniamo
invece molta attenzione a un possibile aumento del rilascio di cellule
staminali, ipotesi razionalmente sostenibile dallĠaumentata sintesi di NO, che,
a livello midollare, pu attivare la metalloproteinasi-9. Se questa ipotesi
potesse avverarsi, lĠozonoterapia diventerebbe un cardine terapeutico dopo un
infarto miocardio o cerebrale, o nellĠischemia degli arti inferiori.
Pur avendo cercato di esaminare il problema, non
siamo ancora riusciti a chiarire la rilevanza dei LOPs per quanto riguarda il
sistema nervoso centrale e il sistema endocrino. La maggioranza dei pazienti
sotto giudizioso trattamento di ozonoterapia, non solo non ha mai riportato
fenomeni tossici acuti o cronici ma, sorprendentemente, godono di una maggiore
energia (probabilmente legata a una migliorata ossigenazione) e di un senso di
benessere ed euforia. é ragionevole ipotizzare una stimolazione neuroendocrina
successiva allĠinfusione del sangue ozonizzato e non sarei sorpreso, quando
potremo eseguire questo studio, di riscontrare un aumento dei livelli
plasmatici di cortisolo, ormone somatotropo e forse anche del
deidroepiandrosterone. Pi difficile sar invece chiarire la rilevanza delle
endorfine e di alcuni neurotrasmettitori. Anche se la prima fase (ROS) ex vivo
sembra disgiunta dalla seconda fase (LOPs) in vivo, in realt esse esprimono un
processo continuo iniziato dallĠozono e continuato dalla cascata dei vari
composti chimici responsabili delle reazioni cellulari.